Pyrosequencing

Posted on by

Definisi : metode yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida dalam DNA, atau sekuensing DNA, yang didasarkan pada deteksi pirofosfat yang dilepaskan (PPi) selama sintesis DNA

Fungsi : mengetahui urutan nukleotida DNA, screening resistensi mikroba, perkembangan obat, epigenetik, dll.

Prinsip kerja :

  • Persiapan sample (menggunakan mesin PCR)
    • Mengambil sampel (bisa dari darah, sputum, urine)
    • DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi fragmen-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.
    • Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA/ssDNA).
    • Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran mikroskopis yang terpisah satu sama lainnya.
    • Reaksi berantai polimerase (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang identik.
  • Pyrosequencing
    • Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan enzim =
      • DNA polimerase = untuk menambah deoksinukleotida pada DNA untai tunggal 
      • ATP sulfurilase = mengubah pirofosfat (PPi) menjadi ATP dengan bantuan Substrat adenosin fosfosulfat (APS)
      • Substrat adenosin fosfosulfat (APS)
      • Luciferase = katalisis luciferin menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya
      • Luciferin = mengubah ATP menjadi oksiluciferin dengan bantuan luciferase
      • Apirase = Degradasi hasil yang sudah tidak digunakan.
    • Salah satu dari empat jenis nukleotida yang membentuk DNA ditambahkan ke tempat, yang mulai dimasukkan ke template DNA untai tunggal oleh DNA polimerase di ujung 3′, melepaskan pirofosfat
    • ATP sulfurilase kemudian mengubah pirofosfat menjadi adenosin trifosfat ( ATP) dengan adanya adenosin 5′ fosfosulfat.
    • ATP kemudian mengambil bagian dalam konversi luciferase yang dimediasi luciferin menjadi oxyluciferin. Proses ini memancarkan cahaya secara proporsional dengan jumlah ATP yang mengambil bagian dalam konversi, yang ditangkap oleh detektor.
    • Nukleotida dan ATP yang tidak terpakai terdegradasi menjadi apirase, memungkinkan reaksi dimulai lagi dengan nukleotida lain. Proses ini diulang, menambahkan setiap nukleotida satu demi satu sampai sintesis selesai.
    • Detektor mengambil intensitas cahaya yang dipancarkan oleh proses, yang kemudian digunakan untuk menyimpulkan jumlah dan jenis nukleotida yang ditambahkan. Misalnya, jika tiga nukleotida sitosin ditambahkan secara berurutan ke fragmen DNA yang sama, cahaya yang dipancarkan akan tiga kali lebih kuat daripada fragmen DNA dengan hanya satu nukleotida sitosin yang ditambahkan.

Dikutip dari :