Definisi : sanger sequencing/metode pemutusan rantai adalah metode untuk menentukan urutan nukleotida DNA.
Metode ini dikembangkan oleh dua kali Peraih Nobel Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977. Metode ini pun sudah sangat lama digunakan, sudah kurang lebih selama 30 tahun. Maka dari itu, penggunaannya sudah jarang digunakan, lebih sering menggunakan New Generation Sequencing (NGS).
Prinsip Kerja
- Sekuens DNA yang akan diteliti digunakan sebagai template untuk jenis PCR khusus yang disebut Chain-Termination PCR. Chain-termination PCR ini bekerja seperti PCR standar, tetapi dengan satu perbedaan utama, yaitu penambahan nukleotida yang dimodifikasi yang disebut dideoksiribonukleotida (ddNTP). ddNTP ini akan ditambahkan ke untai DNA yang sedang bereplikasi. Hasil dari Chain-termination PCR adalah jutaan hingga milyaran salinan oligonukleotida dari urutan DNA yang diteliti, dipotong dengan panjang acak oleh 5′-ddNTPs.
- Pada langkah kedua, oligonukleotida yang diterminasi dipisahkan berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel. Dalam elektroforesis gel, sampel DNA dimasukkan ke dalam salah satu ujung matriks gel, dan arus listrik diterapkan; DNA bermuatan negatif, sehingga oligonukleotida akan ditarik ke arah elektroda positif di sisi berlawanan dari gel. Karena semua fragmen DNA memiliki muatan yang sama per satuan massa, kecepatan pergerakan oligonukleotida hanya akan ditentukan oleh ukuran. Semakin kecil sebuah fragmen, semakin sedikit gesekan yang akan dialaminya saat bergerak melalui gel, dan semakin cepat ia akan bergerak. Akibatnya, oligonukleotida akan diatur dari yang terkecil ke yang terbesar, membaca gel dari bawah ke atas.
- Langkah terakhir adalah membaca gel untuk menentukan sekuens DNA input. Karena DNA polimerase hanya mensintesis DNA dalam arah 5′ ke 3′ mulai dari primer yang disediakan, setiap terminal ddNTP akan berhubungan dengan nukleotida spesifik dalam urutan aslinya (misalnya, fragmen terpendek harus berakhir pada nukleotida pertama dari ujung 5′ , fragmen terpendek kedua harus berakhir pada nukleotida kedua dari ujung 5′, dll.) Oleh karena itu, dengan membaca pita gel dari yang terkecil hingga terbesar, kita dapat menentukan urutan 5′ hingga 3′ dari untai DNA asli.
Dikutip dari: