Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik yang digunakan untuk membuat banyak salinan dari suatu segmen DNA, proses ini akan menghasilkan sejumlah besar salinan dari sampel awal yang kecil agar dapat diteliti dan dipelajari secara detail.
Prinsip Kerja
Prinsip kerja PCR mencontoh bagaimana DNA di dalam tubuh diperbanyak (replikasi DNA). Seperti dalam proses replikasi DNA pada organisme hidup, teknik PCR juga membutuhkan sebuah Enzim DNA polymerase yang bertugas untuk membuat salinan untaian DNA baru dengan menggunakan untaian DNA yang sudah ada sebagai template.
DNA polimerase yang biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA.
Selain Taq polymerase, adanya Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan disalin dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.
Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat dan nukleotida. Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendingan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.
Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:
-
- Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
- Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.
- Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru.
Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi.
Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi menggunakan Gel Electrophoresis. Prinsip dari gel electrophoresis yaitu pemanfaatan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen DNA didalam matriks gel berarus listrik sehingga fragmen DNA terpisah berdasarkan ukurannya. Sebagai standar digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment DNA hasil PCR. Sebagai contoh, reaksi PCR yang menghasilkan fragmen 400 base pair (bp) terlihat seperti pada gel.
Dikutip dari: