Lab Biomedik Dasar (25 Agustus 2022)

Pertemuan hari ini dilaksanakan di gedung C2 lantai 2, kampus FK Unpad Jatinangor, tepatnya di laboratorium biomedik dasar. Kegiatan yang akan dilakukan hari ini adalah diskusi terkait prinsip kerja dalam penggunaan flow cytometry dan simulasi penggunaan micropipet. Sedikit cerita, hari ini juga merupakan hari pertama OPPEK 2022 atau orientasi fakultas sebagai wahana dalam memperkenalkan lingkungan FK Unpad. Saya menjadi salah satu bagian dari kepanitiaan kegiatan tersebut, sehingga kegiatan hari ini rasanya cukup padat.

Dalam kegiatan hari ini, kelompok kami bergabung bersama kelompok dr. Siska dan dibagi menjadi 2 kelompok secara acak. Kegiatan diawali dengan perkenalan dan pemaparan terkait prinsip kerja flow cytometry, kemudian dilanjutkan dengan diskusi yang dipimpin oleh dr. Ghozali. Selanjutnya, kami diarahkan untuk melakukan sebuah simulasi yang menunjukkan tentang bagaimana cara kerja flow cytometry. Flow cytometry bekerja dengan melakukan penyortiran sel berdasarkan bentuk, ukuran, fungsi dan komponen dalam sel tersebut. Simulasi dilakukan dengan menunjuk salah satu anggota untuk berperan sebagai flow cytometry, dengan anggota lain sebagai sel yang akan disortir. Melalui simulasi ini, saya menjadi lebih paham dan terbayang bagaimana cara flow cytometry bekerja dalam menyortir sel yang dibutuhkan. Pendekatan seperti ini cukup membantu dalam meningkatkan pemahaman, meskipun pada awalnya kami sempat kebingungan.

Agenda berikutnya adalah simulasi pipeting. Sebelum melakukan simulasi, kami mendapatkan penjelasan terlebih dahulu mengenai hal-hal yang berkaitan dengan micropipet, seperti bentuk, fungsi, dan cara penggunaannya. Selain penjelasan, kami juga melihat cara penggunaan micropipet yang didemonstrasikan oleh bu Helmi selaku laboran yang bertugas mendampingi kami hari ini.

Berikutnya kami mencoba menggunakan micropipet yang memiliki kapasitas berbeda untuk pengambilan sampel yang terdiri dari ukuran 100-1000 μl, 20-200 μl, dan 2-20 μl.

 

Karena perbedaan ukuran ini, dibutuhkan pula tip (ujung pipet) yang berbeda ukuran dengan seperti gambar berikut:

tip ukuran 100-1000 μl (warna biru) dan ukuran 20-200 μl (warna kuning)
tip ukuran 2-20 μl (warna putih)

Cara pemasangan tip pada mikropipet dilakukan dengan menekan ujung mikropipet ke dalam tip dengan gerakan sedikit memutar. Tempat tip harus selalu ditutup ketika selesai memasangkan tip agar tidak terjadi kontaminasi pada tip yang belum digunakan. Tip yang digunakan untuk berbagai macam sampel harus berbeda untuk menghindari kontaminasi. Tip yang sudah digunakan harus dipisahkan atau dibuang ke dalam wadah khusus. Cara melepas tip dari mikropipet adalah dengan menekan tombol khusus di bagian atas mikropipet.

Cara menggunakan mikropipet diawali dengan mengatur volume yang diinginkan kemudian memegang mikropipet dengan cara seperti ingin meninju dengan ibu jari berada pada bagian pengatur volume seperti gambar berikut:

cara memegang mikropipet

Untuk mengambil sampel, tekan tombol plunger button (bagian ujung atas mikropipet) dengan ibu jari seperti gambar berikut, lalu angkat jempol supaya sampel dapat masuk ke dalam tip.

mengambil sampel dengan menekan ujung atas mikropipet

Saat memasukan sampel ke tabung sampel, tekan plunger button hingga sampel tidak tersisa. Setelah selesai, lepaskan tip dan masukkan ke dalam wadah khusus.

Setelah melakukan simulasi menggunakan mikropipet, kami merapikan kembali alat-alat yang digunakan. Sebagai penutup kegiatan hari ini, kami melakukan foto bersama dan mengucapkan terima kasih kepada bu Helmi dan staff laboratorium biomedik dasar atas pembelajarannya hari ini. Saat itu, kebetulan dr. Ghozali dan bu Nayla telah berpamitan di tengah kegiatan.

Kegiatan hari ini memberikan kesan baru bagi saya karena dapat hadir dalam 2 kegiatan sekaligus, yaitu mengikuti kegiatan OPPEK sekaligus mengikuti salah satu rangkaian kegiatan elektif.

Lab Immunologi (12 Agustus 2022)

Di hari Jum’at berkah ini, saya ingin membagikan sedikit cerita perjalanan saya sebelum sampai di gedung RSP Unpad. Tepat pukul 10 pagi, saya bersama Amara, Geubrina, Zahra, dan Fatiya berkumpul sambil menunggu kendaraan yang akan mengantarkan kami dari Jatinangor ke Bandung. Perjalanan hari ini cukup membuat kami mengantuk dan sekitar pukul 11 kami sampai di Jalan Eyckman No.38. Karena masih ada waktu beberapa jam sebelum pukul 13 siang, kami memutuskan untuk makan siang terlebih dahulu.

Setelah makan siang, kami memutuskan untuk kembali ke gedung RSP Unpad dan menunggu di koridor Laboratorium Immunologi. Kegiatan dimulai pukul 13, saya dan Geubrina menjadi anggota terakhir yang memasuki lab. Pada pertemuan hari ini, bu Nayla berhalangan untuk hadir, sehingga kami didampingi oleh Teh Maria Maharani.

Di dalam lab, kami dibagi menjadi 2 kelompok kecil yang masing-masingnya terdiri dari 4 orang. Saat masuk, saya melihat teman-teman sudah berkumpul dan menyimak penjelasan dari laboran yang sedang bertugas. Saya sendiri sempat tertinggal penjelasan dan telat masuk ke lab karena harus menunggu giliran sholat dzuhur.

Pertama-tama kami mendapatkan penjelasan dan melihat cara kerja alat pendeteksi CD4 yang berfungsi untuk menghitung kadar CD4 dalam sampel darah. Alat pendeteksi CD4 dapat mendeteksi apakah seseorang merupakan suspect HIV/AIDS atau bukan. Alat ini berbentuk seperti komputer kecil dan bekerja dengan mendeteksi sampel yang sudah dimasukan ke dalam catridge khusus. Catridge yang sudah digunakan, tidak dapat digunakan kembali. Jika terjadi error, alat ini akan mengeluarkan kembali catridge yang telah dimasukkan sebelumnya. Data yang dihasilkan dari alat ini dapat dilihat pada komputer khusus yang telah di-setting. Selain itu, kami juga melihat dan dijelaskan terkait berbagai jenis tabung sampel. Tabung sampel ini memiliki warna berbeda, dimana tiap warna tutupnya menunjukan isi dan kegunaan yang berbeda pula. Salah satu contohnya adalah tabung berwarna ungu yang berisi aPTT dan PTT yang berfungsi sebagai agen koagulan untuk mengentalkan sampel darah.

Catridge CD4
Mesin CD4

Selanjutnya, kami diperkenalkan dan melihat secara langsung cara kerja dari alat Genexpert yang berguna untuk mendeteksi COVID-19, atau penyakit lain seperti HIV dan TBC. Alat ini memiliki prinsip kerja yang sama seperti yang telah kami pelajari sebelumnya dan saya pribadi merasa bersyukur karena hal tersebut, sehingga ketika mendapat penjelasan, kami sudah paham dan semakin terbayang bagaimana cara kerja dari alat GeneXpert ini. Selain itu, kami juga mendapat sekilas informasi terkait alat MiSeq yang merupakan alat milik laboratorium genetik molekuler yang disimpan di laboratorium immunologi.

GeneXpert

Selanjutnya, kami mendapatkan penjelasan terkait metode ELISA dan alat atau media yang digunakan dalam metode ini. Dalam kerjanya, metode ELISA ini membutuhkan alat micropipet untuk memindahkan sampel ke dalam microplate. Micropipet ini sangat berperan penting dalam menentukan akurasi jumlah sampel yang digunakan, sehingga metode ELISA ini memerlukan kemahiran dalam menggunakan micropipet. Terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan dalam penggunaan micropipet untuk ELISA ini, antara lain:

    • Tidak menggunakan tip yang sama untuk berbagai sampel
    • Tip tidak boleh menyentuh dinding media, agar tidak merusak reagen pada media
    • Tip harus dibuang ke dalam tempat yang tidak akan menimbulkan kontaminasi
    • Micropipet harus ditempatkan dengan posisi berdiri ketika sudah selesai digunakan

Selain itu, kami juga melihat dan mendapatkan penjelasan terkait cara kerja ELISA reader dan alat pencuci microplate, serta bagaimana cara menganalisis sampel.

Terakhir, kami mempelajari terkait cara kerja flow cytometry (FACS) dengan merk FACSLyric yang dapat mendeteksi hingga 10 warna. Sebelum dimasukkan ke dalam FACS, sampel yang digunakan dapat diberikan pewarna atau stain terlebih dahulu agar dapat memberikan warna yang berbeda ketika dideteksi oleh detektor alat ini. Hasil pembacaan dari alat ini dapat dilihat melalui komputer khusus yang telah terintegrasi.

Hasil pembacaan FACS dapat terlihat di komputer

Penjelasan terkait FACS ini menjadi penutup dari kegiatan pembelajaran di laboratorium hari ini. Sebelum pamit, kami sempat berfoto dan mengucapkan terima kasih kepada para staff ahli laboratorium immunologi RSP Unpad serta Teh Maria yang telah mendampingi dalam proses pembelajaran kami hari ini. Terima kasih dan sehat selalu.

Hb Analyzer

Alat Hb Analyzer

Hb Test adalah alat untuk mengukur kadar hemoglobin dalam darah, bisa dilakukan di hematology analyzer atau alat khususnya sendiri. 

Hb Electrophoresis adalah alat untuk menganalisis berbagai jenis hemoglobin dalam darah, bisa dilakukan menggunakan electrophoresis chamber.

Hematology Analyzer

Hematology analyzer adalah alat laboratorium yang digunakan untuk mengukur dan menghitung jumlah sel darah. Selain itu, pada teknologi terbarunya, alat ini dapat digunakan untuk mengklasifikasikan leukosit dan mengukur kadar hemoglobin.

Prinsip Kerja

Pada alat ini, hemoglobin biasanya diukur secara spektrofotometri. Dalam pengenceran yang mengandung agen hemolitik, sel darah merah melisiskan dan melepaskan hemoglobin, yang bereaksi dengan komponen tertentu dari agen hemolitik untuk menghasilkan turunan hemoglobin stabil yang kolorimetri dalam rentang gelombang cahaya tertentu (530-550 nm). Karena perubahan absorbansi sebanding dengan konsentrasi hemoglobin darah, konsentrasi hemoglobin dapat dihitung.

Hemoglobin Electrophoresis

Hemoglobin elektroforesis merupakan prosedur pemisahan berbagai jenis hemoglobin yang menggunakan prinsip gel electrophoresis dalam prosedurnya, biasa digunakan untuk memeriksa ada atau tidaknya abnormalitas hemoglobin.

Prinsip Kerja

Gel elektroforesis adalah metode pemisahan yang mengandalkan migrasi dari molekul-molekul sampel yang bermuatan akibat adanya pengaruh dari medan listrik dalam sebuah medium. Hemoglobin yang bermuatan positif akan bermigrasi ke arah elektroda negatif (katoda) untuk kemudian dibiarkan bermigrasi menuju anoda. Berbagai jenis hemoglobin memiliki besar muatan yang berbeda yang mempengaruhi kecepatannya bermigrasi. Oleh karena itu, molekul-molekul hemoglobin ini akan terpisah dan membentuk beberapa hemoglobin bands.

Dikutip dari:

Sanger Sequencing

Sanger sequencing, juga dikenal sebagai “metode pemutusan rantai”, adalah metode untuk menentukan urutan nukleotida DNA. Metode ini dikembangkan oleh dua kali Peraih Nobel Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977, oleh karena itu dinamakan Sanger Sequence.

Prinsip Kerja

Urutan DNA untuk PCR terminasi rantai

Urutan DNA yang diinginkan digunakan sebagai cetakan untuk jenis PCR khusus yang disebut PCR pemutusan rantai. PCR pemutusan rantai bekerja seperti PCR standar, tetapi dengan satu perbedaan utama: penambahan nukleotida termodifikasi (dNTPs) yang disebut dideoksiribonukleotida (ddNTPs). Pada langkah ekstensi PCR standar, DNA polimerase menambahkan dNTPs ke untai DNA.

Dalam pengurutan Sanger manual, empat reaksi PCR diatur, masing-masing hanya dengan satu jenis ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, dan ddCTP) yang dicampur. Sedangkan dalam pengurutan Sanger otomatis, semua ddNTP dicampur dalam satu reaksi, dan masing-masing dari empat dNTP memiliki label fluoresen yang unik.

Pemisahan ukuran oleh gel elektroforesis

Pada langkah kedua, oligonukleotida yang diakhiri rantai dipisahkan berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel. Dalam elektroforesis gel, sampel DNA dimasukkan ke salah satu ujung matriks gel, dan arus listrik diterapkan; DNA bermuatan negatif, sehingga oligonukleotida akan tertarik menuju elektroda positif pada sisi gel yang berlawanan. Karena semua fragmen DNA memiliki muatan yang sama per satuan massa, kecepatan pergerakan oligonukleotida hanya akan ditentukan oleh ukuran. Semakin kecil sebuah fragmen, semakin sedikit gesekan yang akan dialaminya saat bergerak melalui gel, dan semakin cepat ia akan bergerak. Akibatnya, oligonukleotida akan disusun dari yang terkecil hingga terbesar, membaca gel dari bawah ke atas.

Dalam sekuensing Sanger manual, oligonukleotida dari masing-masing dari empat reaksi PCR dijalankan di empat jalur gel yang terpisah. Ini memungkinkan pengguna untuk mengetahui oligonukleotida mana yang sesuai dengan setiap ddNTP. Sedangkan dalam sekuensing Sanger otomatis, semua oligonukleotida dijalankan dalam elektroforesis gel kapiler tunggal di dalam mesin sekuensing.

Analisis gel dan penentuan ukuran DNA

Langkah terakhir hanya melibatkan membaca gel untuk menentukan urutan DNA input. Karena DNA polimerase hanya mensintesis DNA dalam arah 5′ ke 3′ mulai dari primer yang disediakan, setiap ddNTP terminal akan sesuai dengan nukleotida spesifik dalam urutan aslinya (misalnya, fragmen terpendek harus berakhir pada nukleotida pertama dari ujung 5′ , fragmen terpendek kedua harus berakhir pada nukleotida kedua dari ujung 5′, dll.) Oleh karena itu, dengan membaca pita gel dari yang terkecil hingga terbesar, kita dapat menentukan urutan 5′ hingga 3′ dari untai DNA asli.

Dalam pengurutan Sanger manual, pengguna membaca keempat jalur gel sekaligus, bergerak dari bawah ke atas, menggunakan jalur untuk menentukan identitas terminal ddNTP untuk setiap band. Misalnya, jika pita bawah ditemukan di kolom yang sesuai dengan ddGTP, maka fragmen PCR terkecil berakhir dengan ddGTP, dan nukleotida pertama dari ujung 5’ dari urutan asli memiliki basa guanin (G).

Dalam pengurutan Sanger otomatis, komputer membaca setiap pita gel kapiler, dengan menggunakan fluoresensi untuk memanggil identitas setiap terminal ddNTP. Singkatnya, laser menggairahkan tag fluoresen di setiap pita, dan komputer mendeteksi cahaya yang dihasilkan yang dipancarkan. Karena masing-masing dari empat ddNTP ditandai dengan label fluoresen yang berbeda, cahaya yang dipancarkan dapat langsung dikaitkan dengan identitas terminal ddNTP. Keluarannya disebut kromatogram, yang menunjukkan puncak fluoresen setiap nukleotida di sepanjang DNA cetakan.

Dikutip dari:

HPLC

Mesin HPLC

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) adalah suatu metode pemisahan molekul dengan media cair yang diberikan tekanan tinggi untuk mengetahui kadar berbagai senyawa kimia.

Prinsip Kerja

Terdapat hal-hal yang berkaitan dengan HPLC, antara lain:

    • Fase gerak dan fase diam
      • Fase gerak = cairan → bisa polar / nonpolar
      • Fase diam = padat/cair → bisa polar / nonpolar
    • Polar dan non polar
      • Polar = larut dalam air, karbon rantai pendek
      • nonPolar = tidak larut dalam air, karbon rantai panjang (≥ 18 rantai)
    • Fase normal dan terbalik
      Penggunaan akan mengacu pada fase ini:

      • Normal = fase diam (polar) & fase gerak (nonpolar)
      • Terbalik = fase diam (nonpolar) & fase gerak (polar)

HPLC memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu (setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu).

Prosesnya: Fase Gerak masuk (solvent dan sample) → dipompa menggunakan pump untuk memberikan tekanan → fase gerak dapat mengalir → masuk ke dalam column → terjadi proses pemisahan → hasil dideteksi → keluar dalam bentuk kromatogram.

Jenis komponen fase gerak dan fase diam akan menentukan hasil (sesama polar akan lebih mudah terikat).

Dikutip dari:

Fluorescence Microscope

Fluorescence microscope adalah salah satu mikroskop cahaya yang menggunakan fenomena fluoresensi untuk mengamati suatu objek, biasanya sampel biologis hidup (struktur sel, mikroorganisme, antibodi).

Fluoresensi sendiri merupakan fenomena di mana suatu molekul bisa menyerap energi dari radiasi gelombang elektromagnetik yang pendek (energinya tinggi dan tidak nampak) untuk kemudian mengeluarkan gelombang yang lebih panjang (energinya lebih rendah dan nampak).

Prinsip Kerja

    1. Alur kerja mikroskop ini dimulai dari gelombang cahaya dengan intensitas/energi tinggi dan panjang gelombang pendek (UV, LED, Laser) yang dipancarkan oleh sumber cahaya.
    2. Cahaya ini kemudian akan difilter oleh filter eksitasi yang sudah diatur sehingga panjang gelombang yang bisa lolos hanya yang sesuai untuk bisa diserap oleh fluorofor.
    3. Setelah difilter cahaya tersebut dipantulkan oleh cermin dichroic dan difokuskan oleh lensa objektif untuk mengenai sampel.
    4. Setelah zat fluorofor pada sampel tersebut menyerap cahaya tersebut, zat fluorofor tersebut pun mengemisikan cahaya dengan gelombang yang lebih panjang dan intensitas yang lebih tinggi.
    5. Cahaya ini kemudian diteruskan oleh lensa objektif dan cermin dichroic, hingga sampai di detector dan bisa diamati.

Dikutip dari:

Inverted Microscope

Inverted Miscroscope (mikroskop terbalik) adalah mikroskop yang ditemukan pada tahun 1850. Disebut mikroskop terbalik, karena lensa objektif yang berada di bawah meja kerja, sedangkan kodensor dan sumber cahaya berada di atas meja kerja.

Inverted Microscope sangat populer untuk pengamatan sel atau jaringan hidup atau organisme di dasar wadah besar (misalnya, labu kultur jaringan) dalam kondisi yang lebih alami, berbeda dari mikroskop konvensional yang menggunakan slide kaca.

Prinsip Kerja

Dengan mikroskop ini, kita akan mengamati spesimen dari bawah, bukan dari atas. Hal ini karena sumber cahaya dan kondensor terletak di atas stage / meja kerja, mengarah ke bawah sedangkan lensa objektif terletak di bawah stage menunjuk ke atas. Oleh karena itu, sel-sel diamati melalui bagian bawah wadah kultur sel. Untuk memenuhi kriteria keberhasilan pengamatan, bagian bawah wadah kultur harus memiliki fitur optik tertinggi.

Mikroskop terbalik digunakan ketika jenis spesimen yang ingin diamati adalah berupa spesimen sel atau jaringan hidup, yang ada di dasar wadah kaca seperti cawan petri, labu kultur jaringan, dan lain-lain.  Baik spesimen yang berukuran besar, sensitif dan rawan terkontaminasi atau mati apabila dikeluarkan dalam wadah kultur. Selain itu, inverted microscope juga dapat digunakan untuk pengamatan sampel metalurgi.

Dikutip dari:

PyroSeq

PyroSeq

PyroSeq merupakan alat sekuensing  yang menggunakan teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

Prinsip Kerja

1.) DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi fragmen-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.

2.) Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA / ssDNA).

3.) Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran mikroskopis yang terpisah satu sama lainnya.

4.) Reaksi berantai polimerase (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang identik.

5.) Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan enzim:

    • DNA polimerase untuk menambah deoksinukleotida pada DNA untai tunggal
    • ATP sulfurilase untuk membentuk ATP dari APS dan pirofosfat (PPi)
    • Luciferase  sebagai katalisis luciferin menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya
    • Apirase
    • Substrat Adenosin Aosfosulfat (APS) dan luciferin

6.) Salah satu dari empat jenis nukleotida yang membentuk DNA ditambahkan ke tempat, yang mulai dimasukkan ke template DNA untai tunggal oleh DNA polimerase di ujung 3′, melepaskan pirofosfat

7.) ATP sulfurilase kemudian mengubah pirofosfat menjadi adenosin trifosfat (ATP) dengan adanya adenosin 5′ fosfosulfat.

8.) ATP kemudian mengambil bagian dalam konversi luciferase yang dimediasi luciferin menjadi oxyluciferin. Proses ini memancarkan cahaya secara proporsional dengan jumlah ATP yang mengambil bagian dalam konversi, yang ditangkap oleh detektor.

9.) Nukleotida dan ATP yang tidak terpakai terdegradasi menjadi apirase, memungkinkan reaksi dimulai lagi dengan nukleotida lain. Proses ini diulang, menambahkan setiap nukleotida satu demi satu sampai sintesis selesai.

10.) Detektor mengambil intensitas cahaya yang dipancarkan oleh proses, yang kemudian digunakan untuk menyimpulkan jumlah dan jenis nukleotida yang ditambahkan. Misalnya, jika tiga nukleotida sitosin ditambahkan secara berurutan ke fragmen DNA yang sama, cahaya yang dipancarkan akan tiga kali lebih kuat daripada fragmen DNA dengan hanya satu nukleotida sitosin yang ditambahkan.

Dikutip dari:

G:BOX

G:BOX

G:BOX atau gel documentation system (sistem dokumentasi gel), gel image system atau gel imager adalah alat untuk pencitraan dan dokumentasi asam nukleat dan protein yang tersuspensi dalam gel poliakrilamida atau agarosa. Gel ini biasanya diwarnai dengan etidium bromida atau pewarna asam nukleat lain seperti GelGreen.

Gel documentation system terdiri dari:

    • Ultraviolet (UV) light transilluminator
    • Hood atau kamar gelap untuk melindungi sumber cahaya eksternal dan melindungi pengguna dari paparan UV
    • Kamera CCD untuk pengambilan gambar

Prinsip Kerja

Untuk aplikasi cahaya sangat rendah tertentu seperti chemiluminescence, gel documentation system juga dirancang dengan kamera berpendingin yang memungkinkan eksposur lebih lama tanpa sensor pemanas. Chemical doc system ini sangat sensitif, memiliki noise rendah dan menghasilkan gambar pita dan bintik samar dalam gel dan blots yang tidak akan terlihat dengan mata telanjang.

Dikutip dari: