Sistem MiSeq menggabungkan teknologi sequencing by synthesis (SBS) dengan alur kerja revolusioner, dari DNA hingga data yang dianalisis hanya dalam waktu delapan jam. MiSeq mengintegrasikan cluster generation, sequencing, dan analisis data pada satu instrumen.
Prinsip Kerja
Sample Prep (Genomic library and adapters)
Setelah DNA dimurnikan, genomic / DNA library, perlu dibuat. Ada dua cara perpustakaan genom dapat dibuat, yaitu dengan cara sonifikasi dan tagmentasi. Dengan tagmentasi, transposase secara acak memotong DNA dan menambahkan adaptor secara bersamaan. Sedangkan, sonifikasi memecah DNA menjadi ukuran yang sama menggunakan gelombang suara ultrasonik.
Adaptor terdiri dari 3 segmen yaitu: complementary sequence to oligos in flow cell, indeks, dan binding site untuk sequencing primer. Indeks adalah barcode sequencing untuk mengidentifikasi sampel, yang akan digunakan oleh komputer untuk mengkategorisasikan setiap sampel saat analisis data. Indeks ini yang membuat MiSeq dapat mengoperasikan lebih dari 96 sampel sekaligus.
Flow cell memiliki oligonukleotida (urutan nukleotida pendek) yang melapisi bagian bawah sel, dan mereka berfungsi sebagai pendukung padat untuk menahan untaian DNA berada di tempatnya selama pengurutan. Saat DNA yang terfragmentasi dicuci di atas sel aliran, adaptor yang sesuai menempel pada pendukung padat komplementer.
Cluster generation by bridge amplification
Setelah terpasang, pembuatan cluster dapat dimulai. Tujuannya adalah untuk membuat ratusan untaian DNA yang identik. Proses ini disebut bridge amplification, dan itu terjadi pada ribuan kelompok di seluruh sel aliran sekaligus.
Sequencing (SBS)
Pada akhir amplifikasi klon, semua untaian terbalik dicuci dari sel aliran, hanya menyisakan untaian maju. Tiga ujung utama diblokir untuk mencegah priming yang tidak diinginkan.
- First read
Sekuensing dimulai dengan perpanjangan primer sekuensing pertama untuk menghasilkan pembacaan pertama. Dengan setiap siklus, nukleotida yang ditandai dengan fluoresensi bersaing untuk menambah rantai yang sedang tumbuh. Setelah penambahan setiap nukleotida, kluster dieksitasi oleh sumber cahaya dan sinyal fluoresen yang khas dipancarkan. Proses kepemilikan ini disebut Sequencing-by-Synthesis. Jumlah siklus menentukan panjang pembacaan. Panjang gelombang emisi, bersama dengan intensitas sinyal, menentukan panggilan dasar.
- Index 1 read
Setelah selesai membaca pertama, produk yang telah dibaca tersapu bersih. Pada langkah ini primer baca indeks 1 diperkenalkan dan dihibridisasi ke template. Bacaan yang dihasilkan mirip dengan pembacaan pertama.
- Index 2 read
Setelah pembacaan indeks selesai, produk yang telah dibaca kemudian dicuci, dan ketiga ujung utama template dideprotect. Template sekarang melipat dan mengikat oligo kedua pada sel aliran. Indeks 2 dibaca dengan cara yang sama seperti indeks 1. Polimerase memperpanjang oligo sel aliran kedua membentuk jembatan untai ganda.
- Reverse strand read
DNA untai ganda ini kemudian dilinearisasi dan ketiga ujung prima diblokir. Untai depan asli dibelah dan hanyut sehingga hanya menyisakan untai sebaliknya. Read 2 dimulai dengan pengenalan primer sequencing read 2. Seperti Read 1, langkah-langkah pengurutan diulang sampai panjang baca yang diinginkan tercapai. Produk Read 2 kemudian dicuci.
Dikutip dari: