Sanger sequencing, juga dikenal sebagai “metode pemutusan rantai”, adalah metode untuk menentukan urutan nukleotida DNA. Metode ini dikembangkan oleh dua kali Peraih Nobel Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977, oleh karena itu dinamakan Sanger Sequence.
Prinsip Kerja
Urutan DNA untuk PCR terminasi rantai
Urutan DNA yang diinginkan digunakan sebagai cetakan untuk jenis PCR khusus yang disebut PCR pemutusan rantai. PCR pemutusan rantai bekerja seperti PCR standar, tetapi dengan satu perbedaan utama: penambahan nukleotida termodifikasi (dNTPs) yang disebut dideoksiribonukleotida (ddNTPs). Pada langkah ekstensi PCR standar, DNA polimerase menambahkan dNTPs ke untai DNA.
Dalam pengurutan Sanger manual, empat reaksi PCR diatur, masing-masing hanya dengan satu jenis ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, dan ddCTP) yang dicampur. Sedangkan dalam pengurutan Sanger otomatis, semua ddNTP dicampur dalam satu reaksi, dan masing-masing dari empat dNTP memiliki label fluoresen yang unik.
Pemisahan ukuran oleh gel elektroforesis
Pada langkah kedua, oligonukleotida yang diakhiri rantai dipisahkan berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel. Dalam elektroforesis gel, sampel DNA dimasukkan ke salah satu ujung matriks gel, dan arus listrik diterapkan; DNA bermuatan negatif, sehingga oligonukleotida akan tertarik menuju elektroda positif pada sisi gel yang berlawanan. Karena semua fragmen DNA memiliki muatan yang sama per satuan massa, kecepatan pergerakan oligonukleotida hanya akan ditentukan oleh ukuran. Semakin kecil sebuah fragmen, semakin sedikit gesekan yang akan dialaminya saat bergerak melalui gel, dan semakin cepat ia akan bergerak. Akibatnya, oligonukleotida akan disusun dari yang terkecil hingga terbesar, membaca gel dari bawah ke atas.
Dalam sekuensing Sanger manual, oligonukleotida dari masing-masing dari empat reaksi PCR dijalankan di empat jalur gel yang terpisah. Ini memungkinkan pengguna untuk mengetahui oligonukleotida mana yang sesuai dengan setiap ddNTP. Sedangkan dalam sekuensing Sanger otomatis, semua oligonukleotida dijalankan dalam elektroforesis gel kapiler tunggal di dalam mesin sekuensing.
Analisis gel dan penentuan ukuran DNA
Langkah terakhir hanya melibatkan membaca gel untuk menentukan urutan DNA input. Karena DNA polimerase hanya mensintesis DNA dalam arah 5′ ke 3′ mulai dari primer yang disediakan, setiap ddNTP terminal akan sesuai dengan nukleotida spesifik dalam urutan aslinya (misalnya, fragmen terpendek harus berakhir pada nukleotida pertama dari ujung 5′ , fragmen terpendek kedua harus berakhir pada nukleotida kedua dari ujung 5′, dll.) Oleh karena itu, dengan membaca pita gel dari yang terkecil hingga terbesar, kita dapat menentukan urutan 5′ hingga 3′ dari untai DNA asli.
Dalam pengurutan Sanger manual, pengguna membaca keempat jalur gel sekaligus, bergerak dari bawah ke atas, menggunakan jalur untuk menentukan identitas terminal ddNTP untuk setiap band. Misalnya, jika pita bawah ditemukan di kolom yang sesuai dengan ddGTP, maka fragmen PCR terkecil berakhir dengan ddGTP, dan nukleotida pertama dari ujung 5’ dari urutan asli memiliki basa guanin (G).
Dalam pengurutan Sanger otomatis, komputer membaca setiap pita gel kapiler, dengan menggunakan fluoresensi untuk memanggil identitas setiap terminal ddNTP. Singkatnya, laser menggairahkan tag fluoresen di setiap pita, dan komputer mendeteksi cahaya yang dihasilkan yang dipancarkan. Karena masing-masing dari empat ddNTP ditandai dengan label fluoresen yang berbeda, cahaya yang dipancarkan dapat langsung dikaitkan dengan identitas terminal ddNTP. Keluarannya disebut kromatogram, yang menunjukkan puncak fluoresen setiap nukleotida di sepanjang DNA cetakan.
Dikutip dari: