Category: Kumpulan Materi

Sistem MiSeq menggabungkan teknologi sequencing by synthesis (SBS) dengan alur kerja revolusioner, dari DNA hingga data yang dianalisis hanya dalam waktu delapan jam. MiSeq mengintegrasikan cluster generation, sequencing, dan analisis data pada satu instrumen.

Prinsip Kerja

Sample Prep (Genomic library and adapters)

Setelah DNA dimurnikan, genomic / DNA library, perlu dibuat. Ada dua cara perpustakaan genom dapat dibuat, yaitu dengan cara sonifikasi dan tagmentasi. Dengan tagmentasi, transposase secara acak memotong DNA dan menambahkan adaptor secara bersamaan. Sedangkan, sonifikasi memecah DNA menjadi ukuran yang sama menggunakan gelombang suara ultrasonik.

Adaptor terdiri dari 3 segmen yaitu: complementary sequence to oligos in flow cell, indeks, dan binding site untuk sequencing primer. Indeks adalah barcode sequencing untuk mengidentifikasi sampel, yang akan digunakan oleh komputer untuk mengkategorisasikan setiap sampel saat analisis data. Indeks ini yang membuat MiSeq dapat mengoperasikan lebih dari 96 sampel sekaligus.

Flow cell memiliki oligonukleotida (urutan nukleotida pendek) yang melapisi bagian bawah sel, dan mereka berfungsi sebagai pendukung padat untuk menahan untaian DNA berada di tempatnya selama pengurutan. Saat DNA yang terfragmentasi dicuci di atas sel aliran, adaptor yang sesuai menempel pada pendukung padat komplementer.

Cluster generation by bridge amplification

Setelah terpasang, pembuatan cluster dapat dimulai. Tujuannya adalah untuk membuat ratusan untaian DNA yang identik. Proses ini disebut bridge amplification, dan itu terjadi pada ribuan kelompok di seluruh sel aliran sekaligus.

Sequencing (SBS)

Pada akhir amplifikasi klon, semua untaian terbalik dicuci dari sel aliran, hanya menyisakan untaian maju. Tiga ujung utama diblokir untuk mencegah priming yang tidak diinginkan.

• First read
  

Sekuensing dimulai dengan perpanjangan primer sekuensing pertama untuk menghasilkan pembacaan pertama. Dengan setiap siklus, nukleotida yang ditandai dengan fluoresensi bersaing untuk menambah rantai yang sedang tumbuh. Setelah penambahan setiap nukleotida, kluster dieksitasi oleh sumber cahaya dan sinyal fluoresen yang khas dipancarkan. Proses kepemilikan ini disebut Sequencing-by-Synthesis. Jumlah siklus menentukan panjang pembacaan. Panjang gelombang emisi, bersama dengan intensitas sinyal, menentukan panggilan dasar.

• Index 1 read
  

Setelah selesai membaca pertama, produk yang telah dibaca tersapu bersih. Pada langkah ini primer baca indeks 1 diperkenalkan dan dihibridisasi ke template. Bacaan yang dihasilkan mirip dengan pembacaan pertama.

• Index 2 read

Setelah pembacaan indeks selesai, produk yang telah dibaca kemudian dicuci, dan ketiga ujung utama template dideprotect. Template sekarang melipat dan mengikat oligo kedua pada sel aliran. Indeks 2 dibaca dengan cara yang sama seperti indeks 1. Polimerase memperpanjang oligo sel aliran kedua membentuk jembatan untai ganda.

• Reverse strand read

DNA untai ganda ini kemudian dilinearisasi dan ketiga ujung prima diblokir. Untai depan asli dibelah dan hanyut sehingga hanya menyisakan untai sebaliknya. Read 2 dimulai dengan pengenalan primer sequencing read 2. Seperti Read 1, langkah-langkah pengurutan diulang sampai panjang baca yang diinginkan tercapai. Produk Read 2 kemudian dicuci.

Dikutip dari:

• • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29423801/
  • https://en.wikipedia.org/wiki/Illumina_dye_sequencing#Sequence_by_synthesis
  • https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html

GeneXpert merupakan alat pemeriksaan molekuler dengan metode “real time“ PCR dan merupakan penemuan terobosan untuk mendiagnosis Mycobacterium tuberculosis (MTB) secara cepat. Selain untuk mendeteksi MTB, alat ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi biomarker pada sel-sel kanker serta pemeriksaan covid-19.

Prinsip Kerja

Prinsip kerja GeneXpert sama dengan mesin PCR namun menggunakan penanda fluoresence pada sampelnya yang berupa reagen di dalam cartridge.

1. 1. Sampel akan diambil menggunakan micropipet dan dimasukan ke dalam cartridge khusus yang sudah berisi reagen.
   2. Selanjutnya pada program di komputer dimasukan data dari sampel pada cartridge, dapat langsung di scan pada barcode cartridge ataupun secara manual.
   3. Cartridge lalu dimasukan ke dalam alat GeneXpert, alat akan menggunakan jarum untuk mengambil sampel yang sudah tercampur dengan reagen di dalam cartridge tersebut.
   4. Alat ini lalu akan melakukan pemeriksaan yang memakan waktu hingga 1,5 jam per sampel cartridge.
   5. Ketika selesai, hasil dari pemeriksaan akan muncul pada program di komputer dan dapat langsung di print.

Dikutip dari:

• • https://www.infolabmed.com/2017/03/genexpert-mtbrif-pengoperasian-alat.html
  • https://www.cepheid.com/en_MY/systems/GeneXpert-Family-of-Systems/GeneXpert-System

Flow cytometry (FCM) merupakan salah satu metode analisis untuk diagnosis berbagai komponen seluler (asam nukleat, lemak, protein), organel (lisosom, mitokondria), bahkan fungsi (viabilitas, aktivitas enzimatis) dari komponen tersebut. Fungsi utamanya untuk mendeteksi abnormalitas sel dalam sampel. FACS merupakan salah satu bentuk dari FCM namun dengan menggunakan fluoresensi untuk sortir dari sel-sel tersebut.

Prinsip Kerja

Flow cytometry menggunakan prinsip menyebarkan cahaya, eksitasi cahaya, dan pemancaran molekul fluorokrom untuk menghasilkan data multi parameter yang spesifik dari partikel dan sel yang memiliki rentang ukuran diameter antara 0,5–40 μm. Secara hidrodinamika, sel-sel difokuskan dalam sebuah tabung sebelum melewati dan disinari oleh sumber cahaya.

Laser merupakan sumber cahaya yang digunakan pada Flow cytometry, dan prinsip kerja yang digunakan memfokuskan hidrodinamika untuk mempresentasikan sel ke sumber cahaya. Pada tahap ini sel akan tersinari oleh laser dan dipresentasikan kembali dalam bentuk suatu diagram tertentu berdasarkan parameter di bawah ini:

• • Parameter FSC (Forward Scatter) merupakan parameter yang menunjukkan ukuran dari sel yang teramati. Prinsip pengukuran dari FSC dilakukan dengan mengukur jarak sinar laser yang terhalangi oleh sel yang diterima Forward Detector. Semakin besar jarak tersebut, maka sel itu memiliki ukuran yang relatif lebih besar.
  • Parameter SSC (Side Scatter) adalah parameter yang menunjukkan struktur internal atau granularitas dari sel yang teramati. Prinsip pengukuran dari SSC dilakukan dengan mengukur jumlah sinar laser yang terhalangi & dibelokkan oleh struktur internal sel yang diterima detektor. Semakin banyak berkas yang dibelokkan dan diterima Side Detector, maka sel itu memiliki struktur internal yang relatif lebih kompleks.

Hasil dari penyinaran tersebut nantinya akan ditampilkan dalam histogram pada komputer.

Dikutip dari:

• • https://biologi.ub.ac.id/fisiologi/wp-content/uploads/sites/9/2019/04/Analisis-Data-Flow-cytometry_id.pdf
  • http://repository.unimus.ac.id/3044/4/BAB%20II.pdf