Nurjanah Sriyanti blog’s

PyroSeq merupakan alat sekuensing  yang menggunakan teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

Prinsip Kerja

1.) DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi fragmen-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.

2.) Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA / ssDNA).

3.) Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran mikroskopis yang terpisah satu sama lainnya.

4.) Reaksi berantai polimerase (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang identik.

5.) Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan enzim:

• • DNA polimerase untuk menambah deoksinukleotida pada DNA untai tunggal
  • ATP sulfurilase untuk membentuk ATP dari APS dan pirofosfat (PPi)
  • Luciferase  sebagai katalisis luciferin menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya
  • Apirase
  • Substrat Adenosin Aosfosulfat (APS) dan luciferin

6.) Salah satu dari empat jenis nukleotida yang membentuk DNA ditambahkan ke tempat, yang mulai dimasukkan ke template DNA untai tunggal oleh DNA polimerase di ujung 3′, melepaskan pirofosfat

7.) ATP sulfurilase kemudian mengubah pirofosfat menjadi adenosin trifosfat (ATP) dengan adanya adenosin 5′ fosfosulfat.

8.) ATP kemudian mengambil bagian dalam konversi luciferase yang dimediasi luciferin menjadi oxyluciferin. Proses ini memancarkan cahaya secara proporsional dengan jumlah ATP yang mengambil bagian dalam konversi, yang ditangkap oleh detektor.

9.) Nukleotida dan ATP yang tidak terpakai terdegradasi menjadi apirase, memungkinkan reaksi dimulai lagi dengan nukleotida lain. Proses ini diulang, menambahkan setiap nukleotida satu demi satu sampai sintesis selesai.

10.) Detektor mengambil intensitas cahaya yang dipancarkan oleh proses, yang kemudian digunakan untuk menyimpulkan jumlah dan jenis nukleotida yang ditambahkan. Misalnya, jika tiga nukleotida sitosin ditambahkan secara berurutan ke fragmen DNA yang sama, cahaya yang dipancarkan akan tiga kali lebih kuat daripada fragmen DNA dengan hanya satu nukleotida sitosin yang ditambahkan.

Dikutip dari:

• • https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/technology-and-research/pyrosequencing-resource-center/pyrosequencing-technology-and-platform-overview
  • https://www.youtube.com/watch?v=wY8to-_zAEo

G:BOX atau gel documentation system (sistem dokumentasi gel), gel image system atau gel imager adalah alat untuk pencitraan dan dokumentasi asam nukleat dan protein yang tersuspensi dalam gel poliakrilamida atau agarosa. Gel ini biasanya diwarnai dengan etidium bromida atau pewarna asam nukleat lain seperti GelGreen.

Gel documentation system terdiri dari:

• • Ultraviolet (UV) light transilluminator
    
  • Hood atau kamar gelap untuk melindungi sumber cahaya eksternal dan melindungi pengguna dari paparan UV
  • Kamera CCD untuk pengambilan gambar

Prinsip Kerja

Untuk aplikasi cahaya sangat rendah tertentu seperti chemiluminescence, gel documentation system juga dirancang dengan kamera berpendingin yang memungkinkan eksposur lebih lama tanpa sensor pemanas. Chemical doc system ini sangat sensitif, memiliki noise rendah dan menghasilkan gambar pita dan bintik samar dalam gel dan blots yang tidak akan terlihat dengan mata telanjang.

Dikutip dari:

• • https://www.bio-rad.com/featured/en/gel-documentation-system.html

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik yang digunakan untuk membuat banyak salinan dari suatu segmen DNA, proses ini akan menghasilkan sejumlah besar salinan dari sampel awal yang kecil agar dapat diteliti dan dipelajari secara detail.

Prinsip Kerja

Prinsip kerja PCR mencontoh bagaimana DNA di dalam tubuh diperbanyak (replikasi DNA). Seperti dalam proses replikasi DNA pada organisme hidup, teknik PCR juga membutuhkan sebuah Enzim DNA polymerase yang bertugas untuk membuat salinan untaian DNA baru dengan menggunakan untaian DNA yang sudah ada sebagai template.

DNA polimerase yang biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA.

Selain Taq polymerase, adanya Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan disalin dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.

Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat dan nukleotida. Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendingan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.

Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:

1. 1. Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
   2. Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.
   3. Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru.

Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi.

 

Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi menggunakan Gel Electrophoresis. Prinsip dari gel electrophoresis yaitu pemanfaatan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen DNA didalam matriks gel berarus listrik sehingga fragmen DNA terpisah berdasarkan ukurannya. Sebagai standar digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment DNA hasil PCR. Sebagai contoh, reaksi PCR yang menghasilkan fragmen 400 base pair (bp) terlihat seperti pada gel.

 

Dikutip dari:

• • https://genecraftlabs.com/id/prinsip-kerja-pcr-serta-penjelasannya/

ELISA (enzyme-linked immunoassay) merupakan teknik yang menggabungkan spesifisitas antibodi dengan sensitivitas uji enzim secara sederhana, dengan menggunakan antibodi atau antigen yang digabungkan ke dalam suatu enzim yang mudah diuji. ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi adanya antigen yang dikenali oleh antibodi atau dapat digunakan untuk menguji antibodi yang mengenali antigen. ELISA menggunakan metode absorbansi cahaya, dimana sampel diukur berdasarkan kemampuannya dalam menyerap cahaya yang diberikan. ELISA sering digunakan untuk mendeteksi infeksi virus, terutama virus yang penularannya melalui darah, seperti HBV, HCV, HIV, dan HTLV.

Prinsip Kerja

Prinsip kerja ELISA dibagi menjadi 4 bagian, antara lain:

Direct

Direct ELISA atau ELISA langsung merupakan jenis teknik ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel darah. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung dengan antibodi yang telah dilabeli oleh enzim.

 

Indirect

Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung pada antibody detector, oleh sebab itu disebut indirect ELISA. Teknik ini memiliki mekanisme yang lebih panjang dari pada direct ELISA.

Sandwich

Sandwich ELISA dikatakan sandwich karena dilihat dari posisi antigen yang berada diantara dua antibodi yakni antibodi yang tertempel pada fase padat (biasa disebut capture antibody) dan antibodi yang yang terkonjugasi dengan enzim (detecting antibody / detector). Dikatakan sandwich karena pada saat sampel dimasukkan  ke dalam well dan diinkubasi, akan terbentuk ikatan bertumpuk seperti sandwich.

Competitive

Competitive ELISA dapat digunakan untuk mengukur antibodi dan antigen menggunakan prinsip dasar dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang microtiter / well. Teknik ini juga memiliki kelebihan, seperti tidak diperlukan pemurnian pada sampel yang mengandung antibodi atau antigen, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen pada competitive ELISA.

 

Dikutip dari:

• • https://andarupm.co.id/category/elisa/
  • http://riset.fk.unsoed.ac.id/2017/04/16/prinsip-elisa/

Sistem MiSeq menggabungkan teknologi sequencing by synthesis (SBS) dengan alur kerja revolusioner, dari DNA hingga data yang dianalisis hanya dalam waktu delapan jam. MiSeq mengintegrasikan cluster generation, sequencing, dan analisis data pada satu instrumen.

Prinsip Kerja

Sample Prep (Genomic library and adapters)

Setelah DNA dimurnikan, genomic / DNA library, perlu dibuat. Ada dua cara perpustakaan genom dapat dibuat, yaitu dengan cara sonifikasi dan tagmentasi. Dengan tagmentasi, transposase secara acak memotong DNA dan menambahkan adaptor secara bersamaan. Sedangkan, sonifikasi memecah DNA menjadi ukuran yang sama menggunakan gelombang suara ultrasonik.

Adaptor terdiri dari 3 segmen yaitu: complementary sequence to oligos in flow cell, indeks, dan binding site untuk sequencing primer. Indeks adalah barcode sequencing untuk mengidentifikasi sampel, yang akan digunakan oleh komputer untuk mengkategorisasikan setiap sampel saat analisis data. Indeks ini yang membuat MiSeq dapat mengoperasikan lebih dari 96 sampel sekaligus.

Flow cell memiliki oligonukleotida (urutan nukleotida pendek) yang melapisi bagian bawah sel, dan mereka berfungsi sebagai pendukung padat untuk menahan untaian DNA berada di tempatnya selama pengurutan. Saat DNA yang terfragmentasi dicuci di atas sel aliran, adaptor yang sesuai menempel pada pendukung padat komplementer.

Cluster generation by bridge amplification

Setelah terpasang, pembuatan cluster dapat dimulai. Tujuannya adalah untuk membuat ratusan untaian DNA yang identik. Proses ini disebut bridge amplification, dan itu terjadi pada ribuan kelompok di seluruh sel aliran sekaligus.

Sequencing (SBS)

Pada akhir amplifikasi klon, semua untaian terbalik dicuci dari sel aliran, hanya menyisakan untaian maju. Tiga ujung utama diblokir untuk mencegah priming yang tidak diinginkan.

• First read
  

Sekuensing dimulai dengan perpanjangan primer sekuensing pertama untuk menghasilkan pembacaan pertama. Dengan setiap siklus, nukleotida yang ditandai dengan fluoresensi bersaing untuk menambah rantai yang sedang tumbuh. Setelah penambahan setiap nukleotida, kluster dieksitasi oleh sumber cahaya dan sinyal fluoresen yang khas dipancarkan. Proses kepemilikan ini disebut Sequencing-by-Synthesis. Jumlah siklus menentukan panjang pembacaan. Panjang gelombang emisi, bersama dengan intensitas sinyal, menentukan panggilan dasar.

• Index 1 read
  

Setelah selesai membaca pertama, produk yang telah dibaca tersapu bersih. Pada langkah ini primer baca indeks 1 diperkenalkan dan dihibridisasi ke template. Bacaan yang dihasilkan mirip dengan pembacaan pertama.

• Index 2 read

Setelah pembacaan indeks selesai, produk yang telah dibaca kemudian dicuci, dan ketiga ujung utama template dideprotect. Template sekarang melipat dan mengikat oligo kedua pada sel aliran. Indeks 2 dibaca dengan cara yang sama seperti indeks 1. Polimerase memperpanjang oligo sel aliran kedua membentuk jembatan untai ganda.

• Reverse strand read

DNA untai ganda ini kemudian dilinearisasi dan ketiga ujung prima diblokir. Untai depan asli dibelah dan hanyut sehingga hanya menyisakan untai sebaliknya. Read 2 dimulai dengan pengenalan primer sequencing read 2. Seperti Read 1, langkah-langkah pengurutan diulang sampai panjang baca yang diinginkan tercapai. Produk Read 2 kemudian dicuci.

Dikutip dari:

• • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29423801/
  • https://en.wikipedia.org/wiki/Illumina_dye_sequencing#Sequence_by_synthesis
  • https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html

GeneXpert merupakan alat pemeriksaan molekuler dengan metode “real time“ PCR dan merupakan penemuan terobosan untuk mendiagnosis Mycobacterium tuberculosis (MTB) secara cepat. Selain untuk mendeteksi MTB, alat ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi biomarker pada sel-sel kanker serta pemeriksaan covid-19.

Prinsip Kerja

Prinsip kerja GeneXpert sama dengan mesin PCR namun menggunakan penanda fluoresence pada sampelnya yang berupa reagen di dalam cartridge.

1. 1. Sampel akan diambil menggunakan micropipet dan dimasukan ke dalam cartridge khusus yang sudah berisi reagen.
   2. Selanjutnya pada program di komputer dimasukan data dari sampel pada cartridge, dapat langsung di scan pada barcode cartridge ataupun secara manual.
   3. Cartridge lalu dimasukan ke dalam alat GeneXpert, alat akan menggunakan jarum untuk mengambil sampel yang sudah tercampur dengan reagen di dalam cartridge tersebut.
   4. Alat ini lalu akan melakukan pemeriksaan yang memakan waktu hingga 1,5 jam per sampel cartridge.
   5. Ketika selesai, hasil dari pemeriksaan akan muncul pada program di komputer dan dapat langsung di print.

Dikutip dari:

• • https://www.infolabmed.com/2017/03/genexpert-mtbrif-pengoperasian-alat.html
  • https://www.cepheid.com/en_MY/systems/GeneXpert-Family-of-Systems/GeneXpert-System

Flow cytometry (FCM) merupakan salah satu metode analisis untuk diagnosis berbagai komponen seluler (asam nukleat, lemak, protein), organel (lisosom, mitokondria), bahkan fungsi (viabilitas, aktivitas enzimatis) dari komponen tersebut. Fungsi utamanya untuk mendeteksi abnormalitas sel dalam sampel. FACS merupakan salah satu bentuk dari FCM namun dengan menggunakan fluoresensi untuk sortir dari sel-sel tersebut.

Prinsip Kerja

Flow cytometry menggunakan prinsip menyebarkan cahaya, eksitasi cahaya, dan pemancaran molekul fluorokrom untuk menghasilkan data multi parameter yang spesifik dari partikel dan sel yang memiliki rentang ukuran diameter antara 0,5–40 μm. Secara hidrodinamika, sel-sel difokuskan dalam sebuah tabung sebelum melewati dan disinari oleh sumber cahaya.

Laser merupakan sumber cahaya yang digunakan pada Flow cytometry, dan prinsip kerja yang digunakan memfokuskan hidrodinamika untuk mempresentasikan sel ke sumber cahaya. Pada tahap ini sel akan tersinari oleh laser dan dipresentasikan kembali dalam bentuk suatu diagram tertentu berdasarkan parameter di bawah ini:

• • Parameter FSC (Forward Scatter) merupakan parameter yang menunjukkan ukuran dari sel yang teramati. Prinsip pengukuran dari FSC dilakukan dengan mengukur jarak sinar laser yang terhalangi oleh sel yang diterima Forward Detector. Semakin besar jarak tersebut, maka sel itu memiliki ukuran yang relatif lebih besar.
  • Parameter SSC (Side Scatter) adalah parameter yang menunjukkan struktur internal atau granularitas dari sel yang teramati. Prinsip pengukuran dari SSC dilakukan dengan mengukur jumlah sinar laser yang terhalangi & dibelokkan oleh struktur internal sel yang diterima detektor. Semakin banyak berkas yang dibelokkan dan diterima Side Detector, maka sel itu memiliki struktur internal yang relatif lebih kompleks.

Hasil dari penyinaran tersebut nantinya akan ditampilkan dalam histogram pada komputer.

Dikutip dari:

• • https://biologi.ub.ac.id/fisiologi/wp-content/uploads/sites/9/2019/04/Analisis-Data-Flow-cytometry_id.pdf
  • http://repository.unimus.ac.id/3044/4/BAB%20II.pdf