Pertemuan Daring 11 Agustus 2022

Posted on August 22, 2022 by oliviapramesthicahyarini

Tibalah kami melakukan presentasi mengenai prinsip-prinsip kerja dari alat-alat yang telah dijelaskan pada pertemuan luring pertama di Laboratorium Biomedik Rumah Sakit Pendidikan Unpad. Sebelumnya, kami telah melakukan undian untuk siapa masing-masing yang mendapatkan alat apa untuk dicari prinsip kerjanya. Berikut merupakan daftar nama dan apa yang mereka peroleh berdasarkan undian yang dilaksanakan:

  1. Flowcytometer atau FACS: Kemal
  2. GenXpert: Kang Rio
  3. Inverted Microscope: Olivia
  4. ELISA: Teh Zahra
  5. Miseq: Fatiya
  6. Pyroseq: Teh Mara
  7. PCR: Teh NJ
  8. HB Analyzer: Teh Geubrina dan Kemal
  9. Fluorescence Microscope: Teh Geubrina
  10. HPLC: Kang Rio dan Teh Mara
  11. Sanger Sequencing:

Flowcytometer: Kemal menjelaskan bahwa flowcytometry merupakan salah satu metode untuk mendiagnosis sel-sel pada sampel berdasarkan komponen, bentuk, ukuran, dan fungsi dari sel tersebut. Nah, salah satu metode adalah Fluorescece-Activated Cell Sorting (FACS), dimana menggunakan fluoresensi untuk langsung menyortir dan mendiagnosis sel-sel pada sampel yang digunakan berdasarkan warna yang terdeteksi. Alat dari flowcytometry disebut dengan flowcytometer.

Flowcytometer menggunakan prinsip penyebaran cahaya, eksitasi cahaya, dan pemancaran molekul fluorokrom untuk menghasilkan data multi parameter yang spesifik dari partikel dan sel yang memiliki rentang ukuran diameter antara 0,5-40 mikrometer. Sumber cahaya dari alat ini berasal dari laser. Secara hidrodinamika, sel-sel difokuskan dalam sebuah tabung sebelum melewati dan disinari oleh sumber cahaya. Parameter cahaya yang ditangkap detektor antara lain:

  1. Parameter FSC (Forward Scatter) merupakan parameter yang menunjukkan ukuran dari sel yang teramati.
  2. Parameter SSC (Side Scatter) adalah parameter yang menunjukkan struktur internal atau granularitas dari sel yang teramati.

GenXpert: Selanjutnya yang akan mempresentasikan mengenai GenXpert adalah Kang Rio. GenXpert merupakan alat yang dapat digunakan untuk mendeteksi materi genetik berbagai patogen dan biomarker sel-sel tertentu. Alat ini bekerja dengan menggunakan prinsip PCR yaitu menggandakan dan mendeteksi dari sel tertentu, contoh Xpert Breast Cancer STRAT4.

Inverted Microscope: Kali ini gantian saya yang mendapat giliran untuk presentasi mengenai inverted microscope. Desain mikroskop ini tu ditemukan oleh J. Lawrence Smith pada tahun 1850 di Tulane University (sebelumnya dikenal sebagai Medical College of Louisiana). Mikroskop ini terutama digunakan untuk memeriksa sampel medis. Mikroskop terbalik ini adalah jenis mikroskop yang terdiri dari sumber cahaya dengan kondensor di atasnya, ditempatkan di atas panggung mikroskop mengarah ke bawah, dan satu set lensa objektif ditempatkan di bawah panggung mengarah ke atas. 

Nah, Mikroskop terbalik itu terdiri dari dua jenis: mikroskop biologis terbalik dan mikroskop terbalik metalurgi. Mikroskop terbalik metalurgi digunakan untuk mengamati dan memeriksa beberapa jenis bagian mekanis dengan perbesaran yang sangat tinggi. Dalam hal ini, sisi halus sampel langsung ditempatkan di atas panggung. Permukaan halus ini dibuat dengan memoles dan dikenal sebagai puck. Mikroskop ini digunakan untuk fraktografi guna mendeteksi patah tulang.

Jika mikroskop metalurgi tersebut digunakan untuk mengamati mikrostruktur dari suatu objek seperti logam dengan perbesaran sekitar 40x, 100x, dan terkadang 200x dan 400x, nah  Mikroskop biologi berbeda dari mikroskop metalurgi karena sampel atau spesimennya ditempatkan di atas cawan Petri dan tidak langsung di atas panggung. Mikroskop ini secara khusus digunakan untuk biologi perkembangan, fertilisasi in-vitro, biologi sel, pencitraan sel hidup, ilmu saraf, dan mikrobiologi.

Bagian-bagian Inverted Microscope:

  • Meja kerja (stage) pada inverted microscope relatif besar dan mampu menampung wadah besar seperti cawan petri.
  • Kondensor mikroskop berada di atas meja kerja, yang digunakan untuk memusatkan cahaya pada spesimen.
  • Lensa yang berfungsi untuk menghasilkan dan memperbesar gambar spesimen. Lensa ini bergerak secara vertikal. Mikroskop terbalik umumnya memiliki 3-6 lensa objektif. 
  • Tombol untuk menyempurnakan pemfokusan untuk mendapatkan gambar yang jernih dan tajam saat melihat melalui lensa okuler.
  • Eyepiece tetap berada di sudut pandang standar seperti mikroskop pada umumnya

ELISA: Setelah pemaparan saya berkenaan dengan inverted microscope selesai, alat selanjutnya adalah ELISA yang akan disampaikan oleh Teh Zahra. ELISA merupakan teknik diagnostik molekuler untuk mendeteksi keberadaan antigen dalam sampel. Pada metode ELISA, spesimen yang biasa dipakai berupa cairan seperti serum atau hasil ekstraksi dalam bentuk infusa berbagai bahan.

Prinsip dasar ELISA adalah mereaksikan antigen dengan antibodi yang berlabel enzim yang kemudian ditambah dengan substrat sehingga akan dihidrolisis menjadi presipitat warna yang dapat dideteksi menggunakan Elisa reader. Pada tahapan akhir Teknik Elisa selalu ditambah dengan stop solution yang berfungsi untuk menghentikan reaksi. Bahan asam kuat biasanya digunakan sebagai larutan stop solution. Jika sedang mencari antibodi, maka plate ELISA di coated dengan antigen yang sesuai. Demikian pula sebaliknya jika sedang mencari antigen maka plate yang disediakan di coated dengan antibodi yang sesuai. 

Miseq: Selanjutnya, Miseq dipresentasikan oleh Fatiya. Alat Miseq Menggabungkan teknologi sequencing by synthesis (SBS), dari DNA hingga data yang dianalisis hanya dalam waktu delapan jam. MiSeq mengintegrasikan cluster generation, sequencing, dan analisis data pada satu instrumen. Prinsip kerja Miseq adalah

  1. Sample Prep (Genomic library and adapters)

Setelah DNA dimurnikan, genomic/DNA library, perlu dibuat. Ada dua cara perpustakaan genom dapat dibuat, sonifikasi dan tagmentasi. Dengan tagmentasi, transposase secara acak memotong DNA dan menambahkan adaptor secara bersamaan. Sonifikasi memecah DNA menjadi ukuran yang sama menggunakan gelombang suara ultrasonik. Adaptor terdiri dari 3 segmen : a) complementary sequence to oligos in flow cell, indeks, dan binding site untuk sequencing primer. Indeks adalah barcode sequencing untuk mengidentifikasi sampel, yang akan digunakan oleh komputer untuk mengkategorisasikan setiap sampel saat analisis data. Indeks ini yang membuat miseq dapat mengoperasikan lebih dari 96 sampel sekaligus. Flow cell memiliki oligonukleotida (urutan nukleotida pendek) yang melapisi bagian bawah sel, dan mereka berfungsi sebagai pendukung padat untuk menahan untaian DNA di tempatnya selama pengurutan. Saat DNA yang terfragmentasi dicuci di atas sel aliran, adaptor yang sesuai menempel pada pendukung padat komplementer.

2. Cluster generation by bridge amplification

Setelah terpasang, pembuatan cluster dapat dimulai. Tujuannya adalah untuk membuat ratusan untaian DNA yang identik. Beberapa akan menjadi untaian depan; sisanya, sebaliknya. Inilah sebabnya mengapa adaptor kanan dan kiri digunakan. Proses ini disebut bridge amplification, dan itu terjadi pada ribuan kelompok di seluruh sel aliran sekaligus.

3. Sequencing (SBS)

Pada akhir cluster generation, semua untaian terbalik dicuci dari sel aliran, hanya menyisakan untaian maju. Tiga ujung utama diblokir untuk mencegah priming yang tidak diinginkan.

First read, Sekuensing dimulai dengan perpanjangan primer sekuensing pertama untuk menghasilkan pembacaan pertama. Dengan setiap siklus, nukleotida yang ditandai dengan fluoresensi bersaing untuk menambah rantai yang sedang tumbuh. Setelah penambahan setiap nukleotida, kluster dieksitasi oleh sumber cahaya dan sinyal fluoresen yang khas dipancarkan. Proses kepemilikan ini disebut Sequencing-by-Synthesis. Jumlah siklus menentukan panjang pembacaan. Panjang gelombang emisi, bersama dengan intensitas sinyal, menentukan panggilan dasar.

Index 1 read, setelah selesai membaca pertama, produk yang telah dibaca tersapu bersih. Pada langkah ini primer baca indeks 1 diperkenalkan dan dihibridisasi ke template. Bacaan dihasilkan, mirip dengan pembacaan pertama.

Pyroseq: Metode yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida dalam DNA, atau sekuensing DNA, yang didasarkan pada deteksi pirofosfat yang dilepaskan (PPi) selama sintesis DNA dengan beberapa fungsi seperti, mengetahui urutan nukleotida DNA, screening resistensi mikroba, perkembangan obat, epigenetik, dll. Prinsip kerja pyroseq sebagai berikut:

  • Persiapan sample (menggunakan mesin PCR)
      • mengambil sample (bisa dari darah, sputum, urine)
      • DNA dipotong menjadi fragmen (ukuran lebih kecil)
      • DNA double strand → single strand
      • diberikan beads
      • duplikasi DNA untuk memperbanyak sample
  • Pyrosequencing
    • sample yang sudah diolah dimasukan ke dalam sumur mikroskopis yang sudah ditambahkan enzim (DNA polimerase, ATP sulfurilase, luciferase, apirase, substrat adenosin fosfosulfat (APS), dan luciferin)
    • enzim mengubah pirofosfat → cahaya
    • cahaya dideteksi sensor
    • keluar hasil

PCR: Polymerase Chain Reaction adalah teknik yang digunakan untuk membuat banyak salinan dari suatu segmen DNA. PCR memiliki beberapa fungsi, seperti mendeteksi keberadaan materi genetik dari sel, bakteri, dan virus. Mendeteksi fungsi sebuah gen. Memutasikan atau mengubah basa tertentu pada DNA. Prinsip kerjanya sama kaya proses replikasi DNA di tubuh kita

  • Denaturation / peleburan (94 – 96℃) → ikatan hidrogen DNA akan terputus → DNA menjadi beruntai tunggal (single-stranded)
  • Annealing / penempelan (55 – 65℃) → primer menempel pada bagian DNA template yang komplementer urutan basa nya
  • Elongation / pemanjangan (72℃) → Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru

Elektroforesis: Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Prinsi kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebu, DNA yang bergerak menuju kutub positig (anoda), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anoda).

HB Analyzer: Hematology analyzer adalah alat laboratorium yang digunakan untuk mengukur dan menghitung jumlah sel darah. Alat yang satu ini mampu melakukan pemeriksaan menggunakan sampel darah untuk mendiagnosa beberapa penyakit.

Secara umum, prinsip kerja hematology analyzer ini terbilang mudah. Yakni sampel darah yang ada dilakukan pencampuran dengan menggunakan campuran reagen untuk hingga terjadi proses yang disebut dengan hemolyzing. Sampel tersebut lalu akan dimasukan ke dalam mesin. Dari proses ini akan terbagi menjadi beberapa tujuan, bisa pengukuran leukosit, trombosit maupun eritrosit. Jika sudah, maka semua data dari sampel darah tersebut akan diolah pada mikroprosesor, dan data akan ditampilkan dalam layar monitor.

Fluorescence Microscope: Salah satu mikroskop cahaya yang menggunakan fenomena fluoresensi untuk mengamati suatu objek, biasanya sampel biologis hidup (struktur sel, mikroorganisme, antibodi). Fluoresensi sendiri merupakan fenomena di mana suatu molekul bisa menyerap energi dari radiasi gelombang elektromagnetik yang pendek (energinya tinggi dan tidak nampak) untuk kemudian mengeluarkan gelombang yang lebih panjang (energinya lebih rendah dan nampak).

Alur kerja mikroskop ini dimulai dari gelombang cahaya dengan intensitas/energi tinggi dan panjang gelombang pendek (UV, LED, Laser) yang dipancarkan oleh sumber cahaya.  Cahaya ini kemudian akan difilter oleh filter eksitasi yang sudah diatur sehingga panjang gelombang yang bisa lolos hanya yang sesuai untuk bisa diserap oleh fluorofor. Setelah difilter cahaya tersebut dipantulkan oleh cermin dichroic dan difokuskan oleh lensa objektif untuk mengenai sampel. Setelah zat fluorofor pada sampel tersebut menyerap cahaya tersebut, zat fluorofor tersebut pun mengemisikan cahaya dengan gelombang yang lebih panjang dan intensitas yang lebih tinggi. Cahaya ini kemudian diteruskan oleh lensa objektif dan cermin dichroic, hingga sampai di detector dan bisa diamati.

HPLC: HPLC adalah kepanjangan High-performance liquid chromatography atau kadang disebut High-pressure liquid chromatography (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/KCKT) adalah sebuah teknik analisis untuk identifikasi zat/senyawa dan memisahkan serta mengukur jumlahnya dalam suatu larutan campuran.

Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.

Sanger Sequencing: Dikenal sebagai “metode pemutusan rantai”. Digunakan untuk menentukan sebagian dari sekuens nukleotida genom individu. Teknik ini menggunakan amplifikasi polymerase chain reaction (PCR) dari region genetik yang diinginkan diikuti dengan sekuensing produk PCR.

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP.

This entry was posted in Greetings. Bookmark the permalink.