Life at FK unpad

Hb test: mengukur kadar hemoglobin dalam darah, bisa dilakukan di hematology analyzer atau alat khususnya sendiri. 

Hb electrophoresis: menganalisis berbagai jenis hemoglobin dalam darah, bisa dilakukan menggunakan electrophoresis chamber.

HEMATOLOGY ANALYZER

Hematology analyzer adalah alat laboratorium yang digunakan untuk mengukur dan menghitung jumlah sel darah. Selain itu, pada teknologi terbarunya, alat ini dapat digunakan untuk mengklasifikasikan leukosit dan mengukur kadar hemoglobin.

Prinsip Kerja

Pada alat ini, hemoglobin biasanya diukur secara spektrofotometri. Dalam pengenceran yang mengandung agen hemolitik, sel darah merah melisiskan dan melepaskan hemoglobin, yang bereaksi dengan komponen tertentu dari agen hemolitik untuk menghasilkan turunan hemoglobin stabil yang kolorimetri dalam rentang gelombang cahaya tertentu (530-550 nm). Karena perubahan absorbansi sebanding dengan konsentrasi hemoglobin darah, konsentrasi hemoglobin dapat dihitung.

HEMOGLOBIN ELECTROPHORESIS

Hemoglobin elektroforesis merupakan prosedur pemisahan berbagai jenis hemoglobin yang menggunakan prinsip gel electrophoresis dalam prosedurnya, biasa digunakan untuk memeriksa ada atau tidaknya abnormalitas hemoglobin.

Prinsip Kerja

Gel elektroforesis → metode pemisahan yang mengandalkan migrasi dari molekul-molekul sampel yang bermuatan akibat adanya pengaruh dari medan listrik dalam sebuah medium. Hemoglobin yang bermuatan positif akan bermigrasi ke arah elektroda negatif (katoda) untuk kemudian dibiarkan bermigrasi menuju anoda. Berbagai jenis hemoglobin memiliki besar muatan yang berbeda yang mempengaruhi kecepatannya bermigrasi. Oleh karena itu, molekul-molekul hemoglobin ini akan terpisah dan membentuk beberapa hemoglobin bands.

Dikutip dari:

• https://andarupm.co.id/mengenal-hematology-analyzer/
  
  
  

Sanger sequencing, juga dikenal sebagai “metode pemutusan rantai”, adalah metode untuk menentukan urutan nukleotida DNA. Metode ini dikembangkan oleh dua kali Peraih Nobel Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977, oleh karena itu dinamakan Sanger Sequence.

Prinsip Kerja

• URUTAN DNA UNTUK PCR TERMINASI RANTAI

Urutan DNA yang diinginkan digunakan sebagai cetakan untuk jenis PCR khusus yang disebut PCR pemutusan rantai. PCR pemutusan rantai bekerja seperti PCR standar, tetapi dengan satu perbedaan utama: penambahan nukleotida termodifikasi (dNTPs) yang disebut dideoksiribonukleotida (ddNTPs). Pada langkah ekstensi PCR standar, DNA polimerase menambahkan dNTPs ke untai DNA.

Dalam pengurutan Sanger manual, empat reaksi PCR diatur, masing-masing hanya dengan satu jenis ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, dan ddCTP) yang dicampur.

Dalam pengurutan Sanger otomatis, semua ddNTP dicampur dalam satu reaksi, dan masing-masing dari empat dNTP memiliki label fluoresen yang unik.

• PEMISAHAN UKURAN OLEH GEL ELECTROPHORESIS

Pada langkah kedua, oligonukleotida yang diakhiri rantai dipisahkan berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel. Dalam elektroforesis gel, sampel DNA dimasukkan ke salah satu ujung matriks gel, dan arus listrik diterapkan; DNA bermuatan negatif, sehingga oligonukleotida akan tertarik menuju elektroda positif pada sisi gel yang berlawanan. Karena semua fragmen DNA memiliki muatan yang sama per satuan massa, kecepatan pergerakan oligonukleotida hanya akan ditentukan oleh ukuran. Semakin kecil sebuah fragmen, semakin sedikit gesekan yang akan dialaminya saat bergerak melalui gel, dan semakin cepat ia akan bergerak. Akibatnya, oligonukleotida akan disusun dari yang terkecil hingga terbesar, membaca gel dari bawah ke atas.

Dalam sekuensing Sanger manual, oligonukleotida dari masing-masing dari empat reaksi PCR dijalankan di empat jalur gel yang terpisah. Ini memungkinkan pengguna untuk mengetahui oligonukleotida mana yang sesuai dengan setiap ddNTP.

Dalam sekuensing Sanger otomatis, semua oligonukleotida dijalankan dalam elektroforesis gel kapiler tunggal di dalam mesin sekuensing.

• ANALISIS GEL & PENENTUAN URUTAN DNA

Langkah terakhir hanya melibatkan membaca gel untuk menentukan urutan DNA input. Karena DNA polimerase hanya mensintesis DNA dalam arah 5′ ke 3′ mulai dari primer yang disediakan, setiap ddNTP terminal akan sesuai dengan nukleotida spesifik dalam urutan aslinya (misalnya, fragmen terpendek harus berakhir pada nukleotida pertama dari ujung 5′ , fragmen terpendek kedua harus berakhir pada nukleotida kedua dari ujung 5′, dll.) Oleh karena itu, dengan membaca pita gel dari yang terkecil hingga terbesar, kita dapat menentukan urutan 5′ hingga 3′ dari untai DNA asli.

Dalam pengurutan Sanger manual, pengguna membaca keempat jalur gel sekaligus, bergerak dari bawah ke atas, menggunakan jalur untuk menentukan identitas terminal ddNTP untuk setiap band. Misalnya, jika pita bawah ditemukan di kolom yang sesuai dengan ddGTP, maka fragmen PCR terkecil berakhir dengan ddGTP, dan nukleotida pertama dari ujung 5’ dari urutan asli memiliki basa guanin (G).

Dalam pengurutan Sanger otomatis, komputer membaca setiap pita gel kapiler, dengan menggunakan fluoresensi untuk memanggil identitas setiap terminal ddNTP. Singkatnya, laser menggairahkan tag fluoresen di setiap pita, dan komputer mendeteksi cahaya yang dihasilkan yang dipancarkan. Karena masing-masing dari empat ddNTP ditandai dengan label fluoresen yang berbeda, cahaya yang dipancarkan dapat langsung dikaitkan dengan identitas terminal ddNTP. Keluarannya disebut kromatogram, yang menunjukkan puncak fluoresen setiap nukleotida di sepanjang DNA cetakan.

Dikutip dari:

• https://www.sigmaaldrich.com/ID/en/technical-documents/protocol/genomics/sequencing/sanger-sequencing

Definisi:

• High = tinggi
• Pressure = tekanan
• Liquid = cairan
• Chromatography = suatu metode pemisahan molekul yang melibatkan fase diam dan fase gerak

HPLC = metode pemisahan molekul dengan media cair yang diberikan tekanan tinggi → mengetahui kadar berbagai senyawa kimia.

Prinsip Kerja

Hal yang berkaitan dengan HPLC:

• Fase gerak dan fase diam
  • Fase gerak = cairan → bisa polar/nonpolar
  • Fase diam = padat/cair → bisa polar/nonpolar
• Polar dan non polar
  • Polar = larut dalam air, karbon rantai pendek
  • nonPolar = tidak larut dalam air, karbon rantai panjang (≥ 18 rantai)
• Fase normal dan terbalik
  Penggunaan akan mengacu pada fase ini
  • Normal = fase diam (polar) & fase gerak (nonpolar)
  • Terbalik = fase diam (nonpolar) & fase gerak (polar)

Secara singkat:

• HPLC memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu (setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu)
• Fase Gerak masuk (solvent dan sample) → dipompa menggunakan pump untuk memberikan tekanan → fase gerak dapat mengalir → masuk ke dalam column → terjadi proses pemisahan → hasil dideteksi → keluar dalam bentuk kromatogram
• Jenis komponen fase gerak dan fase diam akan menentukan hasil (sesama polar akan lebih mudah terikat)

Dikutip dari:

• PENETAPAN KURVA STANDAR SENYAWA TETRA …https://journal.unhas.ac.id › mff › article › download
• HPLC – Pengertian, Fungsi, Prinsip Kerja, Cara Menggunakanhttps://andarupm.co.id › hplc

Inverted Miscroscope (mikroskop terbalik) adalah mikroskop yang ditemukan pada tahun 1850. Disebut mikroskop terbalik, karena lensa objektif yang berada di bawah meja kerja, sedangkan kodensor dan sumber cahaya berada di atas meja kerja.

Inverted microscope sangat populer untuk pengamatan sel atau jaringan hidup atau organisme di dasar wadah besar (misalnya, labu kultur jaringan) dalam kondisi yang lebih alami, berbeda dari mikroskop konvensional yang menggunakan slide kaca.

Prinsip Kerja

1. Dengan mikroskop ini, kita akan mengamati spesimen dari bawah, bukan dari atas. Hal ini karena sumber cahaya dan kondensor terletak di atas stage/meja kerja, mengarah ke bawah sedangkan lensa objektif terletak di bawah stage menunjuk ke atas. 
2. Oleh karena itu, sel-sel diamati melalui bagian bawah wadah kultur sel. Untuk memenuhi kriteria keberhasilan pengamatan, bagian bawah wadah kultur harus memiliki fitur optik tertinggi
3. Mikroskop terbalik digunakan ketika jenis spesimen yang ingin diamati adalah berupa spesimen sel atau jaringan hidup, yang ada di dasar wadah kaca seperti cawan Petri, labu kultur jaringan, dan lain-lain. 
4. Baik spesimen yang berukuran besar, sensitif dan rawan terkontaminasi atau mati apabila dikeluarkan dalam wadah kultur.
5. Selain itu, inverted microscope juga dapat digunakan untuk pengamatan sampel metalurgi.

Dikutip dari:

• https://ibidi.com/content/212-inverted-and-upright-microscopy

Fluorescence microscope adalah salah satu mikroskop cahaya yang menggunakan fenomena fluoresensi untuk mengamati suatu objek, biasanya sampel biologis hidup (struktur sel, mikroorganisme, antibodi)

Fluoresensi sendiri merupakan fenomena di mana suatu molekul bisa menyerap energi dari radiasi gelombang elektromagnetik yang pendek (energinya tinggi dan tidak nampak) untuk kemudian mengeluarkan gelombang yang lebih panjang (energinya lebih rendah dan nampak)

Prinsip Kerja

1. Alur kerja mikroskop ini dimulai dari gelombang cahaya dengan intensitas/energi tinggi dan panjang gelombang pendek (UV, LED, Laser) yang dipancarkan oleh sumber cahaya.
2. Cahaya ini kemudian akan difilter oleh filter eksitasi yang sudah diatur sehingga panjang gelombang yang bisa lolos hanya yang sesuai untuk bisa diserap oleh fluorofor.
3. Setelah difilter cahaya tersebut dipantulkan oleh cermin dichroic dan difokuskan oleh lensa objektif untuk mengenai sampel.
4. Setelah zat fluorofor pada sampel tersebut menyerap cahaya tersebut, zat fluorofor tersebut pun mengemisikan caya dengan gelombang yang lebih panjang dan intensitas yang lebih tinggi.
5. Cahaya ini kemudian diteruskan oleh lensa objektif dan cermin dichroic, hingga sampai di detector dan bisa diamati.

Dikutip dari:

• https://pages.zeiss.com/rs/896-XMS-794/images/ZEISS-Microscopy_Technology-Note_Principles-of-Fluorescence.pdf 
• https://microbeonline.com/fluorescence-microscope-principle-types-applications
• https://microbenotes.com/fluorescence-microscope-principle-instrumentation-applications-advantages-limitations/ 

G:BOX atau gel documentation system (sistem dokumentasi gel), gel image system atau gel imager adalah alat untuk pencitraan dan dokumentasi asam nukleat dan protein yang tersuspensi dalam gel poliakrilamida atau agarosa. Gel ini biasanya diwarnai dengan etidium bromida atau pewarna asam nukleat lain seperti GelGreen.

Gel documentation systemt erdiri dari:

• Ultraviolet (UV) light transilluminator
• Hood atau kamar gelap untuk melindungi sumber cahaya eksternal dan melindungi pengguna dari paparan UV
• Kamera CCD untuk pengambilan gambar 

Prinsip Kerja

Untuk aplikasi cahaya sangat rendah tertentu seperti chemiluminescence, gel documentation system juga dirancang dengan kamera berpendingin yang memungkinkan eksposur lebih lama tanpa sesnsor pemanas. Chemical doc system ini sangat sensitif, memiliki noise rendah dan menghasilkan gambar pita dan bintik samar dalam gel dan blots yang tidak akan terlihat dengan mata telanjang.

Dikutip dari:

• https://www.bio-rad.com/featured/en/gel-documentation-system.html

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik yang digunakan untuk membuat banyak salinan dari suatu segmen DNA, proses ini akan menghasilkan sejumlah besar salinan dari sampel awal yang kecil agar dapat diteliti dan dipelajari secara detail.

Prinsip Kerja

Prinsip kerja PCR mencontoh bagaimana DNA di dalam tubuh diperbanyak (replikasi DNA). Seperti dalam proses replikasi DNA pada organisme hidup, teknik PCR juga membutuhkan sebuah Enzim DNA polymerase yang bertugas untuk membuat salinan untaian DNA baru dengan menggunakan untaian DNA yang sudah ada sebagai template.

DNA polimerase yang biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA. 

Selain Taq polymerase, adanya Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan disalin dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.

Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat dan nukleotida. Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendingan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.

Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:

1. Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
2. Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.
3. Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru.

Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi.

Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi menggunakan Gel Electrophoresis. Prinsip dari gel electrophoresis yaitu pemanfaatan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen DNA didalam matriks gel berarus listrik sehingga fragmen DNA terpisah berdasarkan ukurannya. Sebagai standar digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment DNA hasil PCR. Sebagai contoh, reaksi PCR yang menghasilkan fragmen 400 base pair (bp) terlihat seperti pada gel.

Dikutip dari:

• https://genecraftlabs.com/id/prinsip-kerja-pcr-serta-penjelasannya/

Alat yang menggunakan teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

Prinsip Kerja

1. DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi fragmen-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.
2. Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA/ssDNA).
3. Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran mikroskopis yang terpisah satu sama lainnya.
4. Reaksi berantai polimerase (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang identik.
5. Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan enzim:
   • DNA polimerase = untuk menambah deoksinukleotida pada DNA untai tunggal
   • ATP sulfurilase = membentuk ATP dari APS dan pirofosfat (PPi)
   • Luciferase = katalisis luciferin menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya
   • Apirase
   • Substrat adenosin fosfosulfat (APS) dan luciferin.
6. Salah satu dari empat jenis nukleotida yang membentuk DNA ditambahkan ke tempat, yang mulai dimasukkan ke template DNA untai tunggal oleh DNA polimerase di ujung 3′, melepaskan pirofosfat
7. ATP sulfurilase kemudian mengubah pirofosfat menjadi adenosin trifosfat ( ATP) dengan adanya adenosin 5′ fosfosulfat.
8. ATP kemudian mengambil bagian dalam konversi luciferase yang dimediasi luciferin menjadi oxyluciferin. Proses ini memancarkan cahaya secara proporsional dengan jumlah ATP yang mengambil bagian dalam konversi, yang ditangkap oleh detektor.
9. Nukleotida dan ATP yang tidak terpakai terdegradasi menjadi apirase, memungkinkan reaksi dimulai lagi dengan nukleotida lain. Proses ini diulang, menambahkan setiap nukleotida satu demi satu sampai sintesis selesai.
10. Detektor mengambil intensitas cahaya yang dipancarkan oleh proses, yang kemudian digunakan untuk menyimpulkan jumlah dan jenis nukleotida yang ditambahkan. Misalnya, jika tiga nukleotida sitosin ditambahkan secara berurutan ke fragmen DNA yang sama, cahaya yang dipancarkan akan tiga kali lebih kuat daripada fragmen DNA dengan hanya satu nukleotida sitosin yang ditambahkan.

Dikutip dari:

• https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/technology-and-research/pyrosequencing-resource-center/pyrosequencing-technology-and-platform-overview
• https://www.youtube.com/watch?v=wY8to-_zAEo