Materi Pertemuan ke-3 – Cerita Helika

Menjelajahi Laboratorium Imunologi

Di laboratorium imunologi mempelajari respon imun.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA menggabungkan spesifisitas antibodi dengan sensitivitas uji enzim secara sederhana, dengan menggunakan antibodi atau antigen yang digabungkan ke suatu enzim yang mudah diuji. Seringnya digunakan untuk mendeteksi infeksi virus, terutama yang penularannya melalui darah, seperti HBV, HCV, HIV, dan HTLV.

Jenis-jenis ELISA:

Direct
Indirect
Sandwich
Competitive

Fungsinya untuk membaca mengukur menentukan antigen atau antibodi protein peptid hormon dari sampel (serum, cairan tubuh, air liur, jaringan)

Proses:

Pra-analitik: mendapatkan serum
1. Pengambilan sampel harus diperhatikan (cara pengambilan, transport, media transport)
2. Teknik pengambilan steril atau tidak
3. Serum itu tanpa antikoagulan
  1. Dari darah murni ditampung di tabung
  2. Kemudian dibekukan di suhu ruang selama 2 jam
  3. Diputar dengan centrifuge 3000 RPM selama 10 menit
4. Untuk pengambilan sampel ada:
  1. Tabung berwarna ungu untuk hematologi rutin (berisi EDTA → antikoagulan agar darahnya tidak beku)
  2. Tabung berwarna hijau (berisi heparin)
  3. Tabung berwarna merah (tidak ada gel) untuk serum
  4. Tabung berwarna kuning (ada gel; ada titik-titik kecil untuk darahnya cepat beku; akan ada serum [yang diambil], gel, dan darah)
  5. Tabung berwarna biru (berisi natrium sitrat untuk faktor pembekuan darah dan analisa gas darah)
Analitik: masuk ke ELISA
Proses pengerjaan:
1. 1. Dapat serum atau cairan tubuh
  2. Buat reagen (diluent, enzim substrat, stop solution, standar, watch buffer) yang ada di KIT ELISA (tergantung merek)
  3. Buat reagen kerja diluent ditambahkan konjugat dimasukkan ke plate ELISA
  4. Antibodi menempel di lubang platenya (sudah ada dari sana atau buat sendiri perlu semalam menempelkan antibodi ke wheel)
  5. Serum dimasukkan + diluent sehingga bereaksi lalu diinkubasi untuk mereaksikan antigen-antibodi
  6. Dicuci agar yang tidak berikatan terbuang, kita menginginkan yang menempel saja (berikatan)
  7. Setelah dicuci ditambah substrat diwarnai dengan enzim (agar berikatan kuat) lalu keluar warna karena di ELISA reader yang dibacanya intensitas warna yang terbentuk dari ikatan antigen-antibodi
    1. Jika keluar warna itu yang positif (ada ikatan)
  8. Diberi stop solution agar berhenti reaksinya
  9. Dibaca menggunakan ELISA reader tergantung panjang gelombang
    1. Yang keluar adalah Optical Density (OD) value
    2. Konsentrasi standar harus diencerkan dari konsentrasi tinggi sampai rendah (0)
  10. Analisis OD sampel dibandingkan kurva konsentrasi standar (x,y) dengan KIT ELISA
  11. Akhirnya keluar konsentrasi sampel yang diinginkan
    1. Ada yang menggunakan software buat perhitungan OD dan konsentrasi standar langsung keluar kurvanya
Post analitik: analisis hasil, lapor hasil, tanda tangan hasil (proses pengerjaan)

Catatan tambahan:

Jika sampel berlebih dan KIT ELISA rentangnya terbatas maka harus diencerkan (misal 10 kali), lalu keluar OD konsentrasinya dikali 10, lalu sampel bisa masuk

Perlu diperhatikan:

1. Pelabelan (nama, tanggal lahir, no. ID)
2. Suhu pengiriman harus diperhatikan juga → es jangan sampai langsung terkena serum nanti bisa lisis (ditandai warna merah)

MiSeq

Alat sequencing dari Illumina biasanya untuk uji vaksin
Satu kali running pemeriksaan memakan biaya 300 juta lebih
Alat sangat sensitif maka dari itu harus hati-hati

Viral Load GeneXpert dan CD4

Untuk skrining pasien HIV dan menentukan obat, perlu diperhatikan untuk selalu menggunakan sarung tangan dan hati-hati dengan jarum

GeneXpert bisa memeriksa HCV, HBV, HBsAg, Influenza, Covid

CD4 selalu dikorelasikan dengan viral load, jika CD4 tinggi viral loadnya kecil, antibodi pendek virus sedikit

Proses pengerjaan CD4:

Sampel darah dimasukkan ke tabung EDTA (ungu) terdapat ukuran 6 mL, 3 mL, 2 mL, dan 1 mL
Langsung diaduk dan jangan sampai membeku jika membeku akan terbaca eror di alatnya
Diambil 30 mikron menggunakan mikropipet
Masukkan ke catridge (tempat untuk tes [ada darah] berwarna oranye dan untuk kontrol berwarna abu-abu)
30 mikron masukkan ke selang kecil di catridge
Masukkan ke alat (jangan lupa tulis ID-nya)
Kurang lebih 20 menit prosesnya

Satu hari dilakukan satu QC (Quality Control): low dengan high tesnya HIV.

Metode PCR GeneXpert:

6 ml darah disentrifuge
Keluar plasma masukkan ke lubang catridge sebanyak 1050-1100 mikron
1. Dilebihkan sekitar 50-100 mikron karena terkadang mengalami eror
2. Tidak boleh ada gelembung
3. Yang dipegang bagian samping

Menggunakan prinsip TCM (Tes Cepat Molekuler) karena semua reagen sudah di dalam (B1-B4)
Contoh hasil pengujian untuk penyakit HIV:

Jika virus terbaca di bawah 16 copy/mili: HIV not detected
Jika virus terbaca di antara 16-40 copy/mili: <40 HIV detected
Jika virus terbaca di atas 40 copy/mili: HIV detected

Flow Cytometry

Flow Cytometry menggunakan laser based technique yang bisa menganalisa sel atau partikel berdasarkan fisik (ukuran) atau sifat kimia (membran partikel, karakteristik spesifik). Metode konvensional menggunakan mikroskop, lelah, tidak akurat, kemungkinan salah besar.

Analisa berdasarkan:

Ukuran
Partikel (yang ada di dalamnya)

Fungsi:

Flow cytometry akan memberikan penanda sel sekaligus dalam satu waktu sampai detail
Bisa untuk menghitung sel Hb, leukosit, trombosit
Bisa memberi tahu fungsi sel
Bisa menentukan sel kanker
Analisis DNA
Menegakkan diagnosis
Follow up treatment (sudah dikasih obat cek aktivitasnya)

Proses pengerjaan:

Sampel dimasukkan ke dalam
Sampel masuk satu persatu dibantu fluidic (cairan)
Ada laser, ditembak laser semua arah
Sel diberi penanda yaitu sebuah antibodi yang diberi fluorokrom (warna), dari protein sel (ekstrasel dan intrasel)
Penanda akan menempel di reseptor lalu ketika ditembak laser akan berpendar
Sinyal yang ditangkap akan muncul di grafik (Ct: neutrofil [biru] dan limfosit [hijau])
Sortingnya dengan detect menggunakan label yang berfluoresensi

Terdapat kotak (gate) untuk memisahkan sel satu dengan yang lainnya, harus tahu sel yang mau diambil, maka dari itu diberi marker (penanda sel) spesifik yang dimiliki sel itu.

Markernya custom atau desain hendak memilih warna merah, hijau, atau yang lain, harus tahu mau cari sel apa, marker atau penanda adalah antibodi yang berfluoresensi.